CURSO : LABORATORIO BIOQUIMICA II: GENETICA MOLECULAR
TRADUCCION : BIOCHEMISTRY LABORATORY II: MOLECULAR GENETICS
SIGLA : BIO266E
CRÉDITOS : 10
MÓDULOS : 06
CARÁCTER : MINIMO
DISCIPLINA : BIOLOGIA - MEDICINA
I. DESCRIPCION
Curso experimental orientado al desarrollo y manejo basico de las principales tecnicas utilizadas en un laboratorio de bioquimica.
II. OBJETIVOS
1. Desarrollar capacidad critica que permita analizar datos de las publicaciones.
2. Dise?ar experimentos, resolver problemas y evaluar resultados.
3. Desarrollar rigurosidad metodologica.
4. Desarrollar capacidad de sintesis en el lenguaje.
5. Informar resultados en forma sucinta y precisa.
III. CONTENIDOS
1. Genotecas: Titulacion de fagos en una genoteca de Cdna.
1.1. Preparacion de placas de cultivo.
1.2. Manipulacion de los fagos.
1.3. Determinacion de unidades formadoras de placa.
2. Reaccion en cadena de la polimerasa (PCR).
2.1. Amplificacion de fragmentos de DNA con secuencias adyacentes conocidas.
2.2. Determinacion de la direccion de un inserto en un vector.
3. Transformacion de bacterias competentes.
3.1. Ligacion de fragmentos en un vector de clonamiento.
3.2. Incubacion de las celulas competentes con DNA plasmidial.
3.3. Plaqueo para seleccionar las bacterias que incorporaron el plasmido.
4. Purificacion de DNA plasmidial bacteriano.
4.1. Ruptura de las bacterias.
4.2. Eliminacion del DNA cromosomal.
4.3. Eliminacion de las proteinas.
4.4. Concentracion del DNA plasmidial.
4.5. Analisis de su integridad por electroforesis en gel de agarosa.
5. Purificacion de DNA cromosomal eucariotico.
5.1. Ruptura de la fuente de DNA cromosomal.
5.2. Eliminacion de proteinas y DNA plasmidial.
5.3. Concentracion del DNA cromosomal purificado.
5.4. Analisis de su integridad por electroforesis en gel de agarosa.
5.5. Cuantificacion de la cantidad de DNA cromosomal obtenido.
6. Digestion de DNA plasmidial con endonucleasas de restriccion.
6.1. Incubacion del DNA con enzimas de restriccion.
6.2. Electroforesis de agarosa de los productos de digestion.
6.3. Tincion con bromuro de etidio.
6.4. Realizacion de mapas de restriccion para cada enzima.
7. Digestion de DNA cromosomal con endonucleasas de restriccion.
7.1. Electroforesis en geles de agarosa.
7.2. Separacion de fragmentos de DNA.
7.3. Cuantificacion del fragmento
7.4. Determinacion del peso molecular de fragmentos de DNA.
8. Western blot.
8.1. Fabricacion de geles de poliacrilamida para proteinas.
8.2. Polimerizacion del Gel concentrador.
8.3. Polimerizacion del Gel de resolucion.
8.4. Tincion con Azul de Coomassie.
8.5. Transferencia de las proteinas a membrana de nitrocelulosa.
8.6. Bloqueo de la membrana.
8.7. Incubacion con 1er anticuerpo, lavado.
8.8. Incubacion con el segundo anticuerpo.
8.9. Revelado.
9. Caracterizacion de una enzima.
9.1. Curva de concentracion de una enzima.
9.2. Cinetica de la actividad enzimatica.
9.3. Curva de saturacion de sustrato (Michaelis-Menten).
9.4. Curva de dobles reciprocos (Lineweaver-Burk).
9.5. Determinacion de velocidad maxima (Vmax).
9.6. Determinacion de constante de Michaelis (Km).
9.7. Efecto del pH sobre la actividad enzimatica.
9.8. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimatica.
9.9. Efecto de un inhibidor competitivo sobre los parametros Km y Vmax de una enzima.
9.10. Efecto de un inhibidor no competitivo sobre los parametros Km y Vmax de una enzima.
IV. METODOLOGIA
- Seminarios bibliograficos.
- Desarrollo de experimentos.
- Realizacion de informes escritos.
- Analisis y discusion de los resultados obtenidos durante cada trabajo practico.
V. EVALUACION
- 2 Interrogaciones: 50%
- 5 Informes: 25% - Introduccion: 10%
- Materiales y Metodos: 10%
- Resultados: 40%
- Discusion: 30%
- Bibliografia: 10%
- Controles breves: 15%
- Seminarios bibliograficos: 10%
VI. BIBLIOGRAFIA
Sambrook, J. Molecular Cloning: a laboratory manual. N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.
Van Pelt-Verkuil, E. Principles and technical aspects of PCR amplification. [Dordrecht], Springer, 2008.
Watson, J. The Double Helix: A Personal Account of the Discovery of the Structure of DNA.
Watson, J. D. Molecular Biology of the gene. 6? Edicion.
PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATOLICA DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS / Septiembre 2012
